海洋病原细菌的氯霉素耐药菌株筛选鉴定及质粒消除孟繁梅汪凯潘子强尹德胜艾云灿‘(中山大学生命科学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州)摘要：目的从污染海域筛选非临床氯霉素耐药株，研究耐药基因定位及耐药机制多样性。方法TCBS和EMB选择平板筛选，结合16S rDNA序列分析鉴定耐药株。MIC测定、基因组DNA．RAPD分型和质粒消除评估多样性。结果评估187株氯霉素耐药株的MIC值分布、属种分布、耐药基因定位及耐药机制。发现80株耐药MIC25—1289。g／ml是CLSI／NCCLS(1995年)定义临床标准(MIC12．5斗g／m1)的2。10倍，分布在弧菌科和肠杆菌科主要属种；58株MIC>25Izg／ml基因组DNA．RAPD分型与菌落表型分组结果吻合，显示多样性丰富。采用多轮高温(一43。C)和高浓度(一1％)SDS双重处理和交替培养，77株MIC>25p．g／m1分离株的质粒消除效率为28．6％；55株不能消除耐药表型，暗示染色体编码耐药基因；22株可消除氯霉素耐药表型。其中16株完全消除，暗示质粒独立编码耐药基因，6株部分消除，暗示质粒和染色体分别编码耐药基因。结论来自污染海域环境的非临床氯霉素耐药株可作为新模型，提供耐药基因定位及耐药机制多样性的新视野。关键词：海洋环境；病原细菌；氯霉素；耐药性；基因定位；质粒；消除中图分类号：R378．99文献标识码：AScreening，identification of marine pathogenic bacteria with chloramphenicol resistance and elimination of their plasmidsMengFan—mei，WangKai，PanZi—qiang，YinDe—sheng andAiYun—call(TheStateKeyLab ofBiocontrol，School ofLifeSciences，SunYat．sellUniversity，Guangzhou)ABSTRACTObjectiveTo screen out non—elinieal isolates with ehloramphenicol resistance from polluted marine environment，and study on the diversities of resistance geneIocations and resistance mechanisms．Methods’I．Ile isolates were screened onTCBS andEMB plates containing25I上g／ml chloramphenieol，andCO—identified by16S rDNA sequencing and analysis．’nle diversity of isolates for resistance to chloramphenicol was assayed by determination ofMIC values，genomicDNA-RAPD typing，and plasmid elimination．ResultsThe distributions ofMIC values， genus and species，locations of chloramphenicol resistance gene and resistance mechanisms of187 isolates were deter- mined．80 isolates of them possessedMIC25～128pg／ml up to2～10 times of the standard for clinieaI isolates ofMIC12．51xg／ml recommended by theCLSI／NCCLS(1995)．These isolates were belonged to typical genera withinVibrionaceae andEnterobaeteriaeeae．The58 isolates of them possessingMIC>25I山g／ml had well consistence of ge— nomicDNA—RAPD types with their colony phenotypes showing abundant diversities．By multiple round treatments with high temperature(一43cc)and high concentration(一1％)ofSDSCOUpied with alternative culture procedures．the rate of plasmid elimination for77 isolates ofMIC>251xg／ml was only28．6％．The resistance phenotype of55 isolates were not eliminated suggesting chromosomal locations of resistance genes．The resistance phenotype of22 isolates were eliminated，among them，the resistance of16 isolates were entirely eliminated，suggesting plasmid encoding resistance genes，whereas the other resistance eliminating partially6 isolates indicated both plasmid and chromosome encoded resis— tance genes．ConclusionThe non—clinical isolates from polluted marine environment with chloramphenicol resis．收稿日期：2006．02．23基金项目：国家自然科学基金(No．；No．；No．)，广东省自然科学基金(No．0)，教育部回国留学人员科研启动基金，教育部高等学校骨干教师资助计划，广东省科技计划重点项目(No．2)，中山大学测试科学基金和985．II期专项资助项目。作者简介：孟繁梅．女，生于1965年，在读博士研究生讲师。研究方向：微生物药物耐药性。·通讯作者．E-mail：lssayc@mail．sys。．edu．cn海洋病原细菌的氯霉素耐药菌株筛选鉴定及质粒消除孟蘩梅等 tance were unique models to provide new insights into the diversities of resistance gene locations and their resistance mechanisms．KEYWORDSMarine environment；Pathogenic bacteria；Chloramphenicol；Antibiotic resistance；Gene location；Plasmid；Elimination氯霉素1947年被发现，长期以来一直是临床上治疗血脑屏障和血眼屏障情况下致命感染的特效药，但长期滥用导致病原菌耐药现象严重，削弱治疗效果…。患者中有十万分之一的人有血液系统副作用，在临床上被严格管制使用。氯霉素广谱、高效杀菌力和残留期长等性能，在大农业领域(含畜牧水产养殖业)中被广泛使用。近年来由于环境污染，氯霉素残留导致食品安全贸易争端，残留量超标累计效应可产生血液再生系统的毒副作用；并且食品中毒所引起的氯霉素耐药株感染可导致高死亡率。这些问题都强化了关注环境分离株耐药基因定位、耐药机制多样性及其基因水平转移研究的迫切性。以往关于临床上分离株的研究已建立氯霉素耐药性的模式系统理论基础，已报道多种耐药机制，如酶灭活机制、膜渗透性、外排泵机制和核糖体的蛋白作用位点突变¨一1。乙酰转移酶(CAT)长期被认为是惟一酶灭活机制¨1，但是1995年在氯霉素生产菌株中新发现的磷酸转移酶(CPT)灭活机制[41，启发国内外学者开始考虑研究环境中的非临床分离株的氯霉素耐药性基因水平转移及其耐药机制多样性。本实验室自1998年起开始监测评估南海珠江口海域的抗生素污染及关键耐药基因的水平转移，积累了一大批环境分离株。本文报道海洋病原细菌氯霉素耐药菌株的耐药基因定位及耐药机制多样性。1材料与方法1．1菌株及培养基1999—2002年从南海珠江口分离筛选获得187株氯霉素耐药性海洋病原细菌，由本实验室分离和保藏。LB培养基、TCBS培养基、EMB培养基配方及制备参见文献bI。1．2药敏实验及耐药性MIC测定取实验室保藏的分离株经LB液体培养活化后接种于含25Ixg／ml氯霉素的LB梯度平板，22℃培养24h，取生长者测定MICt引。将氯霉素溶液加入熔化后冷却至50℃左右的TCBS和EMB琼脂中，分别制备终浓度为25、32、64、1281xg／ml的氯霉素平板。定量接种1—2txl菌液，22℃培养24 h，完全抑制菌株生长的最低浓度为MIC值。1．3分离株表型鉴定及属种确定根据TCBS或EMB培养基选择平板上的菌落表型性状鉴定分组㈨。从各组中取有代表性的分离株扩增16SrDNA和测序，做BLAST序列分析，参照平板菌落表型综合确定其属种14】。1．4基因组DNA．RAPD分型用煮沸法制备模板DNA。引物序列(北京赛百胜)：1#CAGGCCCTrC；2撑TGCCGAGCTG；3#AGTCAGCCAC；5撑AGGGGTCTI'G；6#GGTCCCTGAC；8#GTGACGTAGG；10#GTGATCGCAG；11#CAATCGCCGT；12#TCGGCGATAG；13#CAGCACC—CAC。RAPD反应体积为20txl：20—30ng模板DNA，2．5tzmol／L引物，1UTaqDNA聚合酶，各2001山mol／L的dNTPs，500mmol／LKCI，lOOmmol／LTris-HCl(pH9．0)，1．0％TritonX一100，20mmol／LMgcl2。94。C，2rain预变性；94℃，1rain；36。C，1min；72℃，2min，35个循环，72℃延伸5min。反应结束后取lOpJ上1％琼脂糖凝胶电泳。1．5质粒消除试验及质粒检测采用高温和高浓度SDS双重处理的交替培养法15】。接种氯霉素耐药分离株在含0．025％一l％SDS的LB培养基中，430C振荡培养16h，取501xl菌液接种在5mlLB培养基中430C培养16h，再取50山菌液接种5mlLB中370C培养16h，做药敏试验。若耐药性消失，则抽提质粒检测质粒消除情况；若发现质粒难消除，则逐步提高温度和SDS浓度再重复进行。抽提质粒采用MiniBESTPlasmidPurificationKitVer．2．0试剂盒(TaKaRa公司)，操作流程按照说明书进行；或采用SDS一碱裂解法小量抽提。取10“l质粒上l％琼脂糖凝胶电泳。2结果2．1测定187个分离株的氯霉素耐药MIC值共活化出187株(TCBS类群37株，EMB类群150株)，发现全部都是MIC>41．Lg／ml。其中80株的MIC25—128p,g／ml，达到CLSI／NCCLS(1995年)定义临床标准(MIC12．5txg／m1)的2～10倍。EMB类群中，6个分离株MIC25tzg／ml；5个分离株MIC321zg／ml【如EN(3)6】；21个分离株MIC640,g／ml[包括EB(3)12，EB(3)14，EB(3)21，EC(3)8，EK(2)6，EM(3)17，ES(4)29，EM3】；29个分离株MIC1281-Lg／ml【包括EG中国抗生素杂志2006年7月第31卷第7期·439·(3)16，EG(3)4，EJ(3)13，EJ(3)9，EMl0，ENl9，EQ5，ES(4)24，ES(4)3，EX(4)3，EJ(3)30，EP67，EJ(3)6，ES(4)3，EJ23，EJ(4)17，EG(2)3，EJ(4)22，EM28，EM5，EJl22，EM7，EM28—2】。TCBS类群中，3个分离株MIC2599／ml(如TU64，TW38)；6个分离株MIC32斗g／ml[包括TN(3)11，TS(3)12，TS67】；4个分离株MIC64p。g／ml[TJ(3)25，TJ(3)24，TJ(3)2，TU68】；6个分离株MIC128斗g／ml【包括TJ(3)10，TM(3)3，TS(3)15，’rv(3)45，TV74】。上述括号中所列出的菌株号在本文后续研究中有具体分析和讨论(图l～2)。2．2确定77株氯霉素强耐药分离株的属种分布根据TCBS和EMB选择平板上的菌落表型，选取代表株测定16S rDNA序列BLAST分析，综合确定77株分离株分布在弧菌科和肠杆菌科的主要属种。17株TCBS类群(MIC>25“g／m1)中，8株属于霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌[包括TU68，TN(3)11，TM(3)3，TJ(3)10，TV(3)45，TJ(3)24，TJ(3)25】；6株属于副溶血弧菌[包括TS67，TU64，TS(3)12，TV74，TS(3)15】；3株属于假单胞菌属、气单胞菌属[包括TW38，TJ(3)2】。60株EMB类群MIC>25I山g／ml中，30株属于变形菌属、沙门菌属、志贺菌属[包括EJ23，EJ(3)30，ES(4)24，EJl22，EM28，EM5】；6株属于大肠埃希菌[包括EK(2)6，EP67]；24株属于肠杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼菌属、沙雷菌属【包括EM3，EJ(4)22，EG(2)3，EQ5，EMl0，EB(3)12，ES(4)3，EJ(3)9，EM7，EM28．2]。2．3判定58个氯霉素强耐药分离株的基因组DNA．RAPD分型随机选用的10条随机引物(1#～10#)扩增效果都比较好，58株MIC>25¨g／ml基因组DNA—RAPD分型与菌落表型分组结果吻合，显示多样性丰富。引物3撑(ACTCACCCAC)介导的基因组DNA．RAPD分型覆盖面大，可独立区别33株(图1)，但不能独立区别其余25株，或不能扩增出带或连成一片[EK(2)6，EM5，EP42，EP67]；或带型相似[TV(3)45，TU68，TS(3)15]；TM(3)11，TM(3)3；EG(2)3，ES(4)1，EJ(4)17，ES(4)24，EQ5，EJ(4)22；EMl0，ENl9；EB(3)12，EC(3)8；EM7，EM3；TS67，TU64，TV74，TU61。进一步采用引物2}≠(TGCCGAGCTG)区别EK(2)6、EP67、EM5；引物6}}(GGTCCCTGAC)区别EMl0、ENl9；引物13#(CAGCACCCAC)区别TM(3)11、TM(3)3。综合引物10#(CTGATCGCAG)和弓l物11#(CAATCGCCGT)结果可区别EG(2)3、ES(4)l、EJ(4)17、ES(4)24、EQ5、EJ(4)22；综合引物2#和10#结果可区别TV74、TU61。10条随机引物都不能区别开少数菌株TS67与TU64，EB(3)12与EC(3)8，EM7与EM3，7I’s(3)15与TV(3)45，提示两两相同。2．477个氯霉素强耐药分离株的质粒消除及耐药基因初步定位经过多轮高温和高浓度SDS双重处理交替培养。逐渐提高SDS浓度(到1％)和温度(到43℃)，对细菌致死率达到90％以上。统计表明77强耐药分离株(MIC>251xg／m1)的质粒消除率为28．6％。(1)55株不能消除耐药表型，提示染色体编码耐药基因。(2)22株可消除耐药表型(图略)，耐药表型消除前后，可构成22对／44株对照菌株体系。TCBS类群8对／16株【TM圣墨雾萎圣銎圣蚕tr-,萋茨圣詈量至圣霎-7昌銎--F差至。7-萝量喜萝垦妻霎委至圣藿至蚕善至蓍茎薹圣薹垂_至喜萎蕾妻}蓁雪薹蚕喜蚕薹室蚕薹重薹薹萎星萎莹茎詈富星喜薯薹霎蚕室喜蚕萎喜喜t'-,l詈2言-4-詈耋室耋蔓t--圣霎图1引物3#介导的基因组DNA—RAPD分型海洋病原细菌的氯霉素耐药菌株筛选鉴定及质粒消除孟蘩梅等(3)3／TM(3)3P一，TN(3)11／TN(3)11P一，TU68／TU68P一，TS67／TS67P一，TV74／TV74P一，TU64／TU64P一．TU61／TU61P一，TW38／TW38P一】。EMB类群14 g,-J-／28株[EB(3)12／EB(3)12P一，EM(3)20／EM(3)20P一．ES(4)22／ES(4)22P一，ES(4)24／ES(4)24P一，EB(3)21／EB(3)21P一，EJ(3)6／EJ(3)6P一，EC(3)8／EC(3)8P一．EK(2)6／EK(2)6P一，EJ(4)8／EJ(4)8P一，EN(3)6／EN(3)6P一．EM28．2／EM28．2P一，EM7／EM7P一，EP27／EP27P一，EM3／EM3P一】。(3)其中16对／32株只有耐药株能生长，质粒消除子不能生长，表明质粒独立编码耐药基因。(4)另外6个[EN(3)6P一，EJ(4)8P一，EM28。2P一，EM7P一，EP27P一，EM3P一】在氯霉素高浓度(>641xg／m1)下不生长，在低浓度(251xg／m1)下长得较慢、较差(图略)，表明是部分消除耐药表型，提示质粒和染色体分别编码耐药基因。分别采用试剂盒和SDS碱裂解法，都能够重复验证质粒提取结果(图2)。TU68／TU68P一和TU61／TU61P一没有提取到质粒，其余都提取到一个分子量较大的质粒，但图谱上没有预期的消除前、后的质粒缺失，EM(3)20P一等消除子中还提取到1～3个小分子量新质粒，来源不清楚。经过五次重复实验，都重复以上结果，表明结果可信。这些环境分离株中的质粒消除前、后的质粒谱不能简单匹配耐药表型的现象，有待深人探究。3讨论(1)我们自1999—2002年历时四年监控近岸海域污染，并且分离筛选出一大批环境耐药株(尹德胜，2003年硕士学位论文；汪凯，2005年硕士学位论文)。本文所分析的187株氯霉素耐药株广泛分布在弧菌科和肠杆菌科的主要属种，MIC值(25—1281xg／m1)达到NCCLS定义临床耐药株指标(MIC>12．5lxg／m1)121的2—10倍。陆源性污染菌群(EMB)和海域土著优势菌群(TCBS)MIC都达到128txg／ml，提示珠江口海域的氯霉素污染严峻，耐药基因水平转移频繁，严重威胁公共卫生及食品安全，近年来已成为关键科学问题及重大实践需求。来自污染海域的氯霉素耐药株多样性丰富(图1)，从中可发掘耐药株及其表型回复突变株(图2)，为研究耐药基因定位及耐药机制多样性，提供新视野和新材料。(2)以往文献认为临床分离株都以质粒编码的CAT系统为主导机制，可通过质粒消除试验验证【21。高温、高浓度SDS双重处理交替培养法被认为是高效率的质粒消除试验方法b1。本研究却发现77株氯霉素耐药株的质粒消除效率为28．6％，55株不能通过消除质粒来消除耐药表型，表明氯霉素耐药基因整合在染色体上；只有16株可完全消除，表明质粒独立编码耐药基因；另外6株消除子[EN(3)6P一，EJ(4)8P一，EM28—2P一，EM7P一，EM3P一，EP27P一】在氯霉素高浓度(>641xg／m1)下不生长，在低浓度(251xg／m1)下长得较慢、较差(图略)，表明只是部分消除耐药表型，提示质粒和染色体可分别编码耐药基因。还观察到消除子中残留的氯霉素耐药基因有“诱导表达”现象：将回复突变株先接种LB液培养后再接种含氯霉素的固体LB梯度平板培养24h，未见菌体生长；但如果在LB液体中加入一定量氯霉素处理一段时间后，再接种含有氯霉素的LB固体梯度平板培养24h，则菌体能生长，提示质粒编码了主要耐药基因，染色体编码了次要耐药基因。由此可见，环境分离株较之临床分离株提供全局性信息更全面、更丰富，是以往被忽略但值得重视的研究发展方向之一。(3)本文发现质粒消除前、后的质粒谱(图2)不能简单匹配所预期的质粒缺失和耐药表型消失，还发现TU68、TU61没有提取到质粒，多数分离株只能提取到一个分子量较大的质粒，而少数消除子中还出现l～3个小分子量新质粒，具体机制不清楚。这些结果是可重复验证的，推测这些分离株中的氯霉素耐药基因很可喜墨塞蒸奏至薹薹耋藿耋萤蚕蚕量董薹塞謇图2氯霉素耐药株及其耐药表型消除子的质粒比较一ofl卜(I。盟c)芝叫一一盟。至三1＆一N—c)lI_一盟n一∞叫．高二cJ芝口=一c)兰∞．厶也一N一)I山口一N—z∞-dn芝Ⅲ 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